【研究简介】

     Kevin Yehl等人在cell上发表了名为“通过噬菌体尾纤突变改造噬菌体宿主范围并抑制细菌耐药性”的论文。文章中作者通过自然进化和结构建模，确定了 T3 噬菌体尾纤维蛋白中的宿主范围决定区 （HRDR），并开发了一种高通量策略，通过定点诱变对这些区域进行基因工程改造，产生了合成的噬菌体。突变的 HRDR 产生宿主范围改变的噬菌体，而选择的噬菌体通过防止耐药性出现，能够在体外长期抑制细菌生长，并且使用小鼠模型在体内发挥作用。预计这种方法可能有助于创造减缓耐药性发展的下一代抗菌剂，并可能扩展到其他病毒支架以进行广泛的应用。

【研究背景和目的】

    耐药细菌感染的加剧和抗生素资源匮乏迫使开发新的替代疗法。噬菌体疗法因其与抗生素机制不同，能够绕过耐药性问题，因此受到广泛关注。然而，噬菌体依赖宿主细胞受体来识别和感染细菌，受体的突变可能导致噬菌体耐药性。因此，基于噬菌体的治疗通常由多个噬菌体组成，以靶向不同的受体，减少耐药性的产生。

    为了应对这一问题，作者的研究目标是通过工程化噬菌体，改造噬菌体尾纤维的关键区域，扩展其宿主范围并防止耐药性发展。通过靶向这些与宿主识别密切相关的区域，增加噬菌体的多样性，从而提高噬菌体的适应性和效果。

图1.噬菌体设计及其针对细菌突变体的潜在能力

【研究内容与结果】

1. 鉴定 T3 的宿主范围决定区域

    T3 最初通过其尾部纤维与细菌 LPS 结合以进行宿主识别。每个尾纤维由基因 17 产物 gp17 的同源三聚体组成，作者之前已经确定了羧基末端、450-553 氨基酸球状结构域或 gp 17 的“尖端”作为宿主特异性的决定因素。T3 gp17 的尖端区域（残基 454-558）的结构是使用已发表的 T7 gp17 结构（图2）。该结构用于识别 T3 的潜在宿主决定区（图 2B）。gp17 的远端 104 aa 部分形成一个交织的球状结构域，其形状由八链 β 桶（标记为 B 到 I 的链）形成。这些链通过无规则线圈连接，这些线圈由它们连接的 β 链表示。其中三个线圈 CD、EF 和 GH 朝向尾部纤维轴（向内环），并被假设不参与宿主识别。其他四个线圈 BC、DE、FG 和 HI 显示在 β 桶的另一侧，并指向远离尾部光纤（图 2A 和 2B；向外环）。假设这些环可能与宿主表面相互作用，并且可能是宿主范围决定区 （HRDR）。

图2.T3 gp17 的计算结构和对 T3 感染的耐药性出现

    通过用 T3 感染 BL21 3 天，每天重新接种到新鲜培养基中来选择天然噬菌体突变体（图 2C）。噬菌体突变体的产生是因为 T3 消除了野生型 （WT） 细菌并选择耐药细菌突变体，而耐药细菌突变体又选择了 T3 突变体。基于测序和互补测定，大多数细菌突变体在 LPS 生物合成途径中包含改变 T3 主要受体的突变。由于 LPS 突变是细菌对 T3 感染产生耐药性的主要进化途径，因此构建 BL21 的两个 LPS 突变体：BL21 ΔwaaG 突变体缺乏 LPS 的外核，包括 WT T3 用作受体的葡萄糖部分， BL21 ΔwaaC 突变体几乎不含 LPS（图 3B）。两种菌株都含有截短的 LPS，并检测具有扩展宿主范围的噬菌体突变体（在24、48和72小时生长）。使用这两种菌株可以在共培养 24 小时后检测到噬菌体突变体（图 2D，红色和橙色数据点），而细菌耐药性在感染后12小时出现（图 2C 和 2E）。从 BL21 ΔwaaG 和 ΔwaaC 突变体中随机分离出 34 个噬菌斑，并提交进行基因 17 的 Sanger 测序。在分离的 34 个噬菌体中，只有 10 个包含基因 17 中的独特突变组合，其中由 BC 环中的一个突变、FG 环中的一个突变和 HI 环中的四个突变组成。令人惊讶的是，尽管很大一部分噬菌体突变体可以感染 BL21 LPS 突变体，但裂解物未能抑制 WT BL21 中的细菌耐药性（图 2C，图 2E）。总之，这表明噬菌体进化过于受限，无法抑制耐药性。

2. 在 HRDR 中引入遗传变异的策略

    由于这些环中的每一个都相对较小（4-9 aa 长），通过用 NNK 密码子替换目标环中的每个密码子来产生很大的多样性（图 3A），这样环序列在 DNA 水平上完全随机化。为了构建这个文库，将尾纤维基因 17 克隆到质粒中，使用简并寡核苷酸对其进行 PCR 扩增，该寡核苷酸旨在用可变数量的 NNK 密码子替换单个环。将含有基因 17 突变版本的质粒文库转化到大肠杆菌 NEB5α 中，并通过在对数期早期用 T3 感染转化体来重组到 T3 基因组中。感染没有进行超过 3 小时，以尽量减少由 DNA 聚合酶错误获得的随机突变引起的自发噬菌体突变体的富集（图 2、C 和 2E）。

    由于无法对 BC 环的整个序列空间进行详尽采样，因此设计了三个独立的文库，部分随机化 BC 环，其中只有前四个密码子 （BC[1-4]）、中央五个密码子 （BC[3-7]） 或最后四个密码子（BC[6-9]）是随机的。括号中的编号表示密码子在环内的位置（图 S2A 和 S2B）。此外，与 WT T3 相比，生成的文库包含细长的 HI 环，具有一个额外的密码子 （HI[+1]） 或三个额外的密码子 （HI[+3]）（图 3A）。

3. 表征噬菌体文库和细菌 LPS 突变体的筛选

    为了量化文库多样性并确定潜在的文库构建偏差，在文库合成的每个步骤都进行了高通量测序（NGS）（HiSeq）。为了验证关于环随机化产生功能多样性的假设，在 ΔwaaG 和 ΔwaaC LPS 突变体上筛选了噬菌体文库（图 3B），这两种突变体都是 T3 耐药菌株。将每个噬菌体文库连续稀释并排列在这些 LPS 突变菌株上，以量化噬菌斑形成单位 （PFU） 的数量并对每个文库的成功进行评分（图 3C 和 3D）。在 ΔwaaG 和 ΔwaaC 细菌突变体上筛选噬菌体文库表明，特定环的诱变比其他环的诱变更有可能扩大噬菌体宿主范围，从而突出关键的噬菌体-宿主相互作用。每个诱变 HI 环的文库都产生了对 ΔwaaG 和 ΔwaaC LPS 突变体都有效的噬菌体（图 3C）。相比之下，DE和FG环诱变的噬菌体很少表现出对 ΔwaaG 或 ΔwaaC LPS 突变体的感染性（图 3C）。大约一半的针对全部或部分 BC 环的文库产生了能够在 ΔwaaG 或 ΔwaaC 上斑块的噬菌体（图 3C）。因此，得出结论，HI 和 BC 环的诱变可以产生生产性噬菌体突变体，而 DE 和 FG 环按顺序受到尾纤维结构的限制或在受体结合中不起作用。

图 3 噬菌体显示出对野生型 T3 耐药并且可以抑制培养中细菌耐药性的 LPS 突变体的宿主范围扩大

4. 噬菌体可以通过环突变来延迟或防止细菌耐药性

    因为噬菌体可以在 T3 感染进化而来的细菌 LPS 突变体上噬菌斑并感染 LPS 突变体，测试了与 WT T3 相比，这些噬菌体文库是否可以降低耐药性。测量了噬菌体感染后的细菌生长动力学，只有 HI 靶向文库在感染后 24 小时阻止了细菌耐药性（图 3E）。令人惊讶的是，尽管存在 LPS 突变体靶向噬菌体，但 BC 环文库并没有降低耐药性。未知部分噬菌体可能没有功能，或者至少无法识别选择它们的宿主。为了减轻这一限制，测试了连续淘选和扩增是否会发现稀有或生长不良的噬菌体。为了实现这一点，使用了三种不同的突变宿主菌株，ΔwaaG、ΔwaaC 和从 T3 抗性BL21 突变体，称为 PRM01（噬菌体抗性突变体）。淘选实验包括用噬菌体文库以高感染复数（MOI = 0.4）感染所需细菌菌株的新鲜培养物，然后回收后代噬菌体并以较低的 MOI 重复循环 3 次（图 4A）BC[3–7] 和DE文库仍然无法产生能够感染三种测试菌株中任何一种的噬菌体。FG文库的噬菌体，需要初始 MOI = 40（图 4B）。FG 文库也是最难构建的，因为它们的转化效率始终低于其他文库，多样性也较低。剩余的噬菌体文库很容易产生大滴度的噬菌体，这些噬菌体可以感染 T3 耐药菌株，而只需要有限的富集或不需要富集（图 4B）。

    接下来选取实验的 10 个分离的噬菌体以等量混合在一起组成鸡尾酒试剂。混合物中使用的 4 个噬菌体在 BC 环中发生突变，1 个在 FG 环中发生突变，其余 5 个在 HI 环中发生突变。鸡尾酒处理的样品显示细菌滴度随时间下降（图 4C，橙色方块），而 T3 感染的培养物在12小时后反弹至饱和，并保持恒定细菌浓度（图 4C，蓝色圆圈）。鸡尾酒处理的培养物的性能显着优于 T3 处理的培养物（图 4C，蓝色圆圈与橙色方块）。到第 6 天，在混合物处理和 T3 处理的培养物之间观察到细菌载量的最大差异，其中噬菌体混合物处理的样品与 T3 相比，细菌滴度降低了5个数量级（图 4C，蓝色圆圈与橙色方块）。结果，确定的噬菌体混合物表现出与 HI 文库相似的能力，尽管噬菌体种群的遗传多样性要低得多，并且能够在大约 1 周内阻止细菌培养物的再生。相比之下，T3 在12小时后产生可见的耐药性，并且从未设法产生有效的反应来控制细菌种群。

图 4 选定噬菌体的体外和体内活性

5. 自然进化的噬菌体与具有工程化 HRDR 的噬菌体之间的比较

    为了更好地了解噬菌体如何能够抑制细菌耐药性以及是否存在对特定突变或环特性的依赖性，额外分离了噬菌体 （PB） 和 T3 （NM） 的天然突变体，以比较它们的基因组、宿主范围和杀伤效率。通过在一组 BL21 突变体、大肠杆菌 MG1655 （MG1655） 和假结核耶尔森菌 YPIII （YPIII）上涂刷PB 和NM 来确定宿主范围。包括后两种菌株以确定噬菌体工程在多大程度上扩大了宿主范围，因为已知 T3 可以进化出对这两种菌株的感染性。BL21包括最初的三种分离菌株 （ΔwaaG、ΔwaaC 和 PRM01） 以及另外七个随机分离的获得 T3 耐药性的 BL21 突变体 （PRM02-PRM08）（图 4D）。图 4D 以 BL21 上的滴度为参考，总结了 PB 和 NM 的杀伤效率（EOP）。如图 4D 所示，大多数NM 对BL21 显示出广泛的宿主范围，其中 8/11 NM 能够感染所有 10 种菌株，其效率与感染 WT BL21相似。除 ΔwaaG 和 PRM001 外，大多数 T3 耐药菌株的 EOP≥2。NM02 与 NM37 （FG：E525G） 具有相同的突变，但也包含一个额外的突变 （HI：D547G），可恢复 WT BL21 上的噬菌斑能力。5/11 NM 能够感染 MG16555，其中只有 NM21 能够感染 YPIII。

6. PB10 保留特异性并在小鼠皮肤感染模型中具有活性

    为了测试工程化噬菌体是否在体内具有功能并保持选择性，使用小鼠皮肤感染模型测试了噬菌体 PB10，因为它对 PRM 具有广泛的感染性，并且具有亲水性 HI 环；因此，作者预计它会阻止耐药性的发展。麻醉的小鼠被划伤感染，并感染等量的 MG1655、ΔwaaC 和 ΔwaaG 的混合物。感染 1 h后，用 PBS、T3或 PB10处理。

    感染伤口中的 MG1655 浓度不会因所应用的治疗而发生显着变化（图 4E）。用 PBS 或 T3 处理的小鼠显示 ΔwaaG 或 ΔwaaC 计数没有显着降低。另一方面，6/6 只用 PB10 处理的小鼠没有可计数的 ΔwaaG 集落（图 4E），5/6 只小鼠没有可计数的 ΔwaaC 集落（图 4E）；一只小鼠的 ΔwaaC 计数非常低。得出结论 PB10 能够复制和清除伤口中的 ΔwaaG 和 ΔwaaC。重要的是，这些结果表明 PB 在动物组织中保持选择性和活性。

【讨论】

    本文中提出了一种强大而简单的方法来生产和筛选具有扩展宿主范围的工程噬菌体文库，并表明这些工程噬菌体能够抑制细菌对噬菌体感染的耐药性。本文描述的方法侧重于产生具有细微宿主范围改变的活噬菌体，以靶向抗性突变体。将诱变定向到预期最高效的尾纤维区域，即 HRDRs。由于这些区域很短，可以使潜在的序列空间饱和，并产生具有多种功能的大型噬菌体文库，这些功能范围从更特异性到更宽的宿主范围。设想宿主范围决定因素的高通量诱变和表征将成为破译病毒对宿主识别的重要且有用的工具。随着越来越多的病毒尾部成分被结构解析和测序，该策略可应用于的病毒模型的广度也将扩大。

【启示】

    本篇文章提供在宿主范围扩展、高通量筛选及体内验证等方面的创新策略，为我公司未来的研发工作提供了重要的技术参考。

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本文译自：

Engineering Phage Host-Range and Suppressing Bacterial Resistance through Phage Tail Fiber Mutagenesis

编译: 赖瑞林 李孟霖