【摘要】

随着抗生素耐药性问题的日益严峻，噬菌体疗法作为一种替代方案重新受到关注。本文介绍了一种名为“Appelmans协议”的噬菌体定向进化方法，通过迭代培养噬菌体混合物（噬菌体鸡尾酒），使其能够裂解原本抗药的细菌菌株。研究团队通过实验验证了该协议的有效性，并发现噬菌体之间的重组是其扩展宿主范围的主要机制。这一发现为噬菌体疗法的临床应用提供了新的思路，也为噬菌体的遗传进化研究提供了重要参考。

【研究背景】

抗生素耐药性：全球健康的重大威胁

根据世界卫生组织（WHO）的报告，抗生素耐药性问题正在迅速发展，人类正面临一个“后抗生素时代”，许多常见感染可能变得无药可治。这一问题的严重性促使科学家们重新审视噬菌体疗法的潜力。

噬菌体疗法的复兴

噬菌体是专门感染细菌的病毒，具有高度特异性。与抗生素不同，噬菌体能够随着细菌的进化而进化，从而克服细菌的抗药性。近年来，噬菌体疗法被重新提上议程，成为应对抗生素耐药性的重要策略之一。

Appelmans协议：噬菌体进化的关键方法

Appelmans协议是一种基于经验的液体噬菌体滴定方法，最早由Appelmans在20世纪20年代开发。该协议通过迭代培养噬菌体混合物，使其能够裂解原本抗药的细菌菌株。尽管这一方法在东欧和前苏联国家的实验室中被广泛应用，但其具体机制尚未被深入研究。

【研究内容与结果】

实验设计

研究团队采用了一种改良的Appelmans协议（图1），使用三种噬菌体（ΦKZ、Pa2和RWG）组成的混合物，针对八种噬菌体抗性（包括实验室常用菌株）和两种噬菌体敏感的铜绿假单胞菌菌株进行实验。通过30轮选择，研究团队成功分离出具有显著扩展宿主范围的噬菌体。

图1 实验方案

噬菌体和细菌菌株的选择

实验中使用的噬菌体包括ΦKZ（一种大型烈性Myoviridae家族噬菌体）、Pa2（一种N4噬菌体）和RWG（另一种N4噬菌体）。细菌菌株包括三种常见的实验室菌株（PAO1、PA14和PAK）以及七种临床分离的铜绿假单胞菌菌株（WCC176、WCC199、WCC201、WCC205、WCC222、WCC229和WCC232）。这些临床分离株来自德克萨斯州卢博克市西南区域伤口护理中心的患者伤口拭子，具有高度的抗生素耐药性。

培养和实验条件

实验中，细菌菌株在补充了1 mM CaCl₂和1 mM MgSO₄的LB培养基中生长。噬菌体RWG和Pa2通过感染PAO1进行培养，MOI约为0.1。经过3-5小时的37°C、250 rpm振荡培养后，通过加入CHCl₃进行裂解，然后离心去除细胞碎片，上清液在4°C下保存于CHCl₃上。ΦKZ则在半固体培养基上培养。

宿主范围的扩展

通过30轮选择，噬菌体混合物能够裂解所有10种测试的铜绿假单胞菌菌株，而原始噬菌体仅能裂解两种实验室菌株（图2）。研究还发现，噬菌体在不同宿主菌株上的适应性存在差异，某些噬菌体在非宿主菌株上表现出更高的生长效率。

图2 从第30轮鸡尾酒中分离出的单个噬菌体的宿主范围

与每10轮鸡尾酒裂解范围对比

宿主范围的评估

研究团队通过在不同宿主菌株上进行噬菌体滴度测定，评估了噬菌体的宿主范围。结果显示，经过30轮选择后，噬菌体混合物在所有测试菌株上均能形成清晰的噬菌斑，表明其宿主范围显著扩展。特别是phi176噬菌体，能够在所有10种菌株上形成噬菌斑，显示出100%的宿主范围。

效率的差异

在不同宿主菌株上，噬菌体的效率（EOP）表现出显著差异（图3）。例如，phi176在PAO1上的EOP为73.6，而在PA14上仅为9.6×10⁻⁵。这种差异表明，噬菌体在不同宿主上的适应性不同，可能与其尾纤维蛋白的结构变化有关。

图3 分离噬菌体平板效率（EOP）和标准偏差（SD）

EOP=噬菌体在测试菌株上的效价 (pfu/mL)/ 噬菌体在对照菌株上的效价 (pfu/mL)

噬菌体的重组机制

实验结果显示，噬菌体之间的重组是扩展宿主范围的主要机制。研究团队对一种具有广泛宿主范围的噬菌体phi176进行了基因组分析，发现其基因组是由Pa2和RWG的基因组通过至少48次重组事件形成的，仅包含一个自发的错义突变。这一发现表明，噬菌体的进化主要依赖于基因重组，而非单纯的突变。

基因组分析

phi176的基因组序列显示，其大约2/3的基因组来自Pa2，其余来自RWG。研究团队通过比对Pa2、RWG和phi176的基因组，确定了至少48个重组位点（图4）。这些重组事件分布在多个基因中，其中一些基因可能直接影响噬菌体的宿主范围。

图4 phi176基因组的示意图及其重组衍生

黄色框：表示来源于Pa2噬菌体的遗传物质

黑色框：表示来源于RWG噬菌体的遗传物质

关键基因的重组

phi176的ORF52基因（编码尾纤维/尾刺蛋白）经历了六次重组事件，并获得了一个单点突变（图5）。该基因在噬菌体吸附过程中起关键作用，可能通过改变尾纤维蛋白的结构来适应不同的宿主菌株。此外，phi176的ORF43基因（编码rIIB样蛋白）也经历了多次重组，表明该基因在适应不同宿主时受到强烈选择压力。

图5 重组 phi176 ORF

噬菌体基因组的镶嵌性与模块的交换

噬菌体基因组的结构类似于拼图，每个基因组代表一个独特的可交换模块的组合。这种镶嵌性为噬菌体提供了极大的遗传多样性，使其能够通过重组快速适应新的宿主。

噬菌体基因组的模块化结构使其能够通过同源重组、非同源重组和位点特异性重组等方式交换基因模块。这种机制不仅增加了噬菌体的遗传多样性，还为其快速适应新的环境压力提供了基础。

重组的频率和位置

研究发现，重组事件在基因组中的分布并非随机。较大的基因（如phi176的ORF70，编码病毒RNA聚合酶）几乎完全保留了其原始序列，而较小的基因则经历了更多的重组事件。这种非随机性可能与基因的功能和选择压力有关。

噬菌体的适应性进化与路径

在Appelmans协议中，噬菌体通过多轮选择不断适应新的宿主菌株。研究团队观察到，噬菌体在不同宿主上的适应性进化路径存在差异，某些噬菌体在特定宿主上表现出更高的适应性。

通过比较不同噬菌体在多种宿主上的生长效率，研究团队发现，噬菌体的适应性进化路径可能因宿主的不同而不同。例如，phi176在WCC229上的EOP为50.0，而在WCC232上仅为39.3，表明其在不同宿主上的适应性存在差异。

适应性进化的机制

噬菌体的适应性进化主要通过基因重组实现。研究发现，phi176的ORF52基因在不同宿主上的适应性进化中起关键作用。该基因的重组和突变可能改变了尾纤维蛋白的结构，从而使其能够识别不同的宿主受体。

【讨论】

Appelmans协议通过基因重组机制为噬菌体疗法提供了一种高效、灵活的方法，能够快速扩展噬菌体的宿主范围，显著增强其对抗多重耐药菌株的能力。这一协议的核心优势在于其快速生成多样化噬菌体混合物的能力，使其不仅适用于实验室研究，还在临床治疗中展现出巨大潜力。例如，在应对多重耐药铜绿假单胞菌感染时，Appelmans协议生成的噬菌体混合物能够提供更广泛的抗菌效果，从而为患者带来更有效的治疗方案。

从进化机制的角度看，噬菌体的重组机制为研究病毒遗传进化提供了全新的视角。相比传统的突变驱动进化，重组允许噬菌体通过交换基因模块快速适应新的环境压力。这种机制在自然界中可能广泛存在，为噬菌体快速适应抗药菌株提供了生物学基础。此外，噬菌体的进化还涉及突变和水平基因转移等复杂机制，这些机制的协同作用使其能够在复杂环境中快速适应，为病毒进化研究提供了宝贵的模型。

尽管噬菌体疗法在实验室中表现出色，其临床应用仍面临诸多挑战，包括噬菌体的稳定性、宿主免疫反应以及监管和标准化问题。为克服这些障碍，未来的研究需要优化Appelmans协议，例如通过调整噬菌体混合物的组成、选择压力的强度和持续时间等实验条件来提高效率。同时，结合现代基因组学技术，可以更深入地解析噬菌体重组的分子机制，从而设计更高效的协议。此外，噬菌体疗法与其他治疗手段（如抗生素）的联合应用也值得探索，这种协同作用可能通过破坏细菌生物膜等方式显著提升治疗效果。

噬菌体的重组机制为研究病毒的遗传进化提供了新的视角。与传统的突变驱动的进化不同，噬菌体通过重组迅速适应新的环境压力。这种机制可能在自然界中广泛存在，为噬菌体的快速进化提供了基础。

【启示】

Appelmans协议为行业开发广谱、高适应性的噬菌体制剂提供了有效工具，尤其适用于应对多重耐药菌的快速变化。其通过重组机制扩展宿主范围的能力，启发噬菌体产品研发中可引入“定向进化”策略，加快适应性优化。同时，该研究强调了噬菌体疗法与抗生素等手段的联合应用潜力，对噬菌体产品开发提供了关键思路，同时也为公共卫生贡献力量。

本文译自：

Directed in Vitro Evolution of Therapeutic Bacteriophages: The Appelmans Protocol.

编译:  张圣海、李孟霖