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【文献速递】内溶素Lys1472在鸡肉抗产气荚膜梭菌的应用及潜在治疗效果

发布时间：

2026-06-26

【研究简介】

产气荚膜梭菌是一种全球公认的引发食源性疾病的病原体。在本研究中，来自产气荚膜梭菌2-2的假定内溶素基因Lys1472被克隆并在大肠杆菌中表达。Lys1472具有与GH25_溶菌酶同源的催化结构域和两个SH3B结合结构域，对受试的 30 株产气荚膜梭菌裂解覆盖率达 100%，裂解活性优异，并在最佳条件下（即温度-20~50°C、pH 4~10和0~500 mM的NaCl）保持稳定。多数测试金属离子仅略微降低 Lys1472 的裂解活性，Zn²⁺和 Fe²⁺则会完全抑制其活性。用Lys1472处理大蜡螟幼虫24 h时，其存活率提高到85%。在4°C下，经Lys1472分别处理0、3、6和12 h时，鸡胸肉上产气荚膜梭菌的生长受到抑制，减少了3个对数级。在25°C下，经Lys1472分别处理0、3和6 h时，鸡胸肉上产气荚膜梭菌的生长受到抑制，也可减少3个对数级。本研究结果表明，Lys1472可作为控制和治疗食源性产气荚膜梭菌污染的替代方案。

【研究背景和目的】

产气荚膜梭菌是一种常见的厌氧致病菌，主要通过受污染的禽肉制品引发食物中毒，这已成为全球关注的食品安全问题，尤其是在鸡肉及其制品中。鸡肉作为该病原体的主要传播媒介，对公共卫生构成了严峻挑战。当前，传统的化学防腐剂在应用中存在影响食品品质或潜在健康风险等局限性，且抗生素耐药性问题日益突出。因此，亟需开发一种安全、高效且无残留的新型生物防治策略。内溶素作为一种具有高特异性、广谱裂解活性且不易诱导耐药性的噬菌体衍生酶，被视为替代抗生素和化学防腐剂的理想选择。尽管已有研究证实内溶素在控制部分食品中的产气荚膜梭菌具有有效性，但其在鸡肉保鲜及体内治疗方面的应用潜力尚待深入挖掘。基于此，本研究旨在克隆并表达一种新型内溶素Lys1472，系统评估其生化特性、裂解活性，并探究其在抗感染治疗及鸡肉防腐保鲜中的实际应用价值。

【研究内容与结果】

本研究首先通过生物信息学分析对Lys1472进行了初步鉴定，随后利用基因工程技术实现了该蛋白的原核表达与纯化，并在此基础上系统评估了其体外裂解活性和生化特性，通过体内幼虫模型及鸡肉保鲜实验验证了其应用潜力。具体研究内容如下：

1. Lys1472的生物信息学分析与蛋白表达

研究团队首先对产气荚膜梭菌2-2菌株进行了全基因组测序。结果显示，该基因组长度为3.4 Mb，GC含量为28.0%，并成功预测到一个假定内溶素基因——Lys1472（图1A）。该基因全长1029 bp，编码342个氨基酸，预测分子量约为39.7 kDa（图2A）。结构域预测表明，Lys1472由一个糖苷水解酶家族25（GH25）的催化结构域（CD）和两个SH3B细胞壁结合结构域（CBD）组成（图1B，1C）。通过SWISS-MODEL构建的三维结构模型进一步展示了其空间构象（图1D）。系统发育分析显示，Lys1472与梭菌噬菌体内溶素CP_phiCp-B及vB_CpeS-1181亲缘关系密切（图1E，1F）。

在明确基因信息后，构建了pET-28a-Lys1472重组质粒并在大肠杆菌中进行诱导表达。SDS-PAGE电泳结果显示，在约39.7 kDa处有一条明显的特异性条带（图2A，原文Lane 3），表明Lys1472已成功表达并经亲和层析纯化。牛津杯抑菌圈实验证实，纯化后的Lys1472对产气荚膜梭菌10具有显著的裂解活性（图2B）。

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图1. Lys1472的生物信息学分析

（A）产气荚膜梭菌2-2基因组图谱，黄色标注为假定内溶素基因。

（B）基于序列分析预测的功能结构域。催化结构域（CD）属于糖苷水解酶家族25的肽酶样家族，具有10个活性位点。

（C）Lys1472结构示意图。InterProScan结果显示其包含糖苷水解酶家族25和两个SH3B结构域。

（D）Lys1472结构预测。由SWISS-MODEL服务器预测的Lys1472三维结构模型。

（E）系统发育树。使用MEGA 7软件，通过邻接法生成，数值代表1000次自举值。

（F）氨基酸序列比对。Lys1472与梭菌噬菌体phiCp-B（QTZ82852）及vB_CpeS-1181（QTZ83006）内溶素的序列比对结果。红色背景白字表示保守残基，白底红字表示相似氨基酸。

提取自20260622公众号-1版.png

2. Lys1472的体外裂解活性与抑菌谱分析

通过浊度降低法测定发现，Lys1472呈现出剂量依赖性的裂解效果。在40 min内，10 μg/mL的Lys1472能使菌液OD₆₀₀下降约62.0%（图2C）。通过显微镜观察进一步印证了这一结论，随着Lys1472浓度从1 μg/mL增至100 μg/mL，细菌存活率从92.4%急剧下降至1.3%，细菌形态遭到严重破坏（图3A, 3B, 3C）。抑菌谱测定结果显示，Lys1472对实验选取的30株不同毒素型（A-G型）的产气荚膜梭菌均表现出100%的裂解活性，但对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等其他受试菌株无效（表1），表现出极高的种属特异性。

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图2. Lys1472的表达及其裂解活性

（A）Lys1472的PCR图谱及亲和层析产物的SDS-PAGE分析。M：DNA ladder/蛋白marker；Lane 1：pET-28a片段；Lane 2：Lys1472 DNA片段；Lane 3：亲和层析纯化后的Lys1472-His蛋白。

（B）Lys1472（10 μg/mL）的裂解活性。采用牛津杯法确认其裂解活性。

（C）不同浓度Lys1472的裂解活性曲线。实验重复三次，结果以均值 ± 标准误（S.E.M.）表示。

3. Lys1472的生化稳定性研究

为了评估Lys1472在实际应用中的适用性，研究测试了其在不同环境条件下的稳定性。结果表明，Lys1472在-20°C~50°C的温度范围以及pH 4~10的宽广范围内均能保持较高的裂解活性（图4A, 4B）。在金属离子影响方面，Zn²⁺和Fe²⁺会完全灭活Lys1472，而Mg²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺和Ca²⁺仅使其活性降低约22%（图4C）。值得注意的是，Lys1472表现出极强的耐盐性，即使在500 mM NaCl浓度下仍保留约77.3%的活性，这暗示其在腌制食品中具有潜在应用价值（图4D）。

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图3. Lys1472裂解活性的显微镜检查

（A）Leica DMi8显微镜观察结果。不同浓度Lys1472处理产气荚膜梭菌10后的显微照片。

（B）荧光显微照片。使用LIVE/DEAD细菌活力试剂盒染色，绿色代表活细胞，红色代表死细胞。

（C）存活率统计。通过ImageJ软件计数活菌。实验重复三次，结果以均值 ± 标准误表示。

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图4. 不同温度（A）、pH（B）、金属离子（C）及NaCl（D）对Lys1472（10 μg/mL）裂解活性的影响。

所有OD₆₀₀值均归一化为初始OD₆₀₀＝1.0，并减去相应的对照值。实验重复三次，结果以均值 ± 标准误表示。

4. Lys1472的体内治疗效果评价

利用大蜡螟幼虫感染模型，研究评估了Lys1472的体内治疗潜力。实验设置了预防组（感染前给药）、联合治疗组（同时给药）和治疗组（感染后给药）。结果显示，阳性对照组幼虫在感染后24 h内全部死亡，而预防组、联合治疗组和治疗组的存活率分别高达85%、80%和65%（图5A）。这一结果有力地证实了Lys1472在对抗产气荚膜梭菌感染方面具有显著的保护作用。

5. Lys1472在鸡肉保鲜中的应用效果

最后，研究团队将Lys1472应用于模拟污染的鸡胸肉样品中，以验证其实际保鲜效果。在4°C冷藏条件下，Lys1472处理组在0、3、6和12 h均使细菌数量降低了3个对数级，24 h后仍保持显著抑菌效果；在25°C常温条件下，处理组同样在0、3和6 h内实现了3个对数级的杀菌效果（图5B）。这表明Lys1472能够有效抑制鸡肉表面的产气荚膜梭菌定殖，具备作为天然食品防腐剂的良好应用前景。

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图5. 内溶素Lys1472的应用及潜在治疗效果

（A）不同实验组幼虫的存活率曲线。

（B）在4°C和25°C下不同时间点，Lys1472在鸡胸肉上的裂解活性评估。实验重复三次，结果以均值 ± 标准误表示。使用Student’s t检验确定显著差异（*, P < 0.05; ****, P < 0.0001）。

【讨论】

本文的讨论部分围绕产气荚膜梭菌的防控难题展开，深入剖析了新型内溶素Lys1472的结构特征、理化性质、治疗效果及其在食品安全领域的应用潜力，主要涵盖以下四个核心方面：

1. 结构特征与高效裂解活性

研究首先分析了Lys1472的结构基础。Lys1472拥有GH25_溶菌酶催化域和SH3B结合域，这种双功能域结构与其优异的裂解活性密切相关。实验数据显示，仅需10 μg/mL的低浓度Lys1472即可产生显著的溶菌效果，其活性显著优于既往报道的PlyCP10（需100 μg/mL）。此外，Lys1472对涵盖 A、B、C、D、E、G 共 6 种毒素型的30株产气荚膜梭菌均表现出100%的裂解率，展现出优异且广谱的杀菌活性，这为其在实际生产中降低应用成本、提高防控效率提供了理论依据。

2. 卓越的环境耐受性与适应性

针对食品加工和保存环境的复杂性，本研究重点探讨了Lys1472的稳定性。结果显示，Lys1472在-20°C~50°C的温度区间及pH 4~10的宽广范围内均能保持稳定活性，这一特性使其能够适应弱酸性或碱性等较为苛刻的食品加工环境。特别值得一提的是，Lys1472表现出极强的耐盐性，即使在500 mM NaCl浓度下仍保留约77%的活性，这一显著优势克服了传统防腐剂在高盐腌制食品中失效的短板，极大拓宽了其应用场景。同时，研究也指出Zn²⁺和Fe²⁺会完全抑制其活性，这提示在实际应用中需注意避免与特定金属离子的接触。

3. 体内模型的显著疗效

在生物治疗层面，本研究利用大蜡螟幼虫感染模型验证了Lys1472的体内应用价值。实验结果表明，Lys1472能显著提高感染幼虫的存活率，尤其在预防性给药组中，幼虫存活率高达85%。这一发现不仅证实了Lys1472作为抗感染制剂的治疗潜力，也响应了全球对抗抗生素耐药性细菌的迫切需求，为替代传统抗生素治疗产气荚膜梭菌感染提供了新的策略。

4. 食品保鲜的实际应用价值

讨论最后聚焦于Lys1472在鸡肉保鲜中的实际效果。实验数据显示，无论是在4°C冷藏还是25°C常温条件下，Lys1472均能有效降低鸡胸肉表面的细菌负荷（降低3个对数级），其抑菌效果与生菜、牛奶等其他食品体系中报道的内溶素（如cpp-lys、LysCPAS15）相当。这有力证实了Lys1472作为一种天然、无残留的生物防腐剂，能够有效延长食品货架期并降低食物中毒风险，在保障禽肉产品安全方面具有广阔的应用前景。

【启示】

综合本研究的实验结果与讨论分析，Lys1472展现出的优异特性为解决产气荚膜梭菌污染难题提供了多维度的科学启示，不仅验证了其作为生物制剂的可行性，更指明了未来的应用方向。

首先，在食品安全控制领域，Lys1472为禽肉产品的绿色保鲜提供了创新性的解决方案。鉴于其能够有效降低鸡肉表面的细菌载量且耐受高盐环境，该内溶素极具潜力被开发为一种天然、无残留的新型生物防腐剂。这不仅契合了当前消费者对“清洁标签”及无添加剂食品的迫切需求，也为解决腌制肉制品中细菌顽固存活的行业痛点提供了有力工具，有助于从源头降低食源性疾病的发生风险，保障公共卫生安全。

其次，在临床及兽医学治疗方面，Lys1472表现出显著的抗生素替代潜力。面对日益严峻的细菌耐药性危机，内溶素疗法已成为国际研究热点。本研究中Lys1472在幼虫感染模型中展现出的高存活率保护效果，充分证明了其在对抗产气荚膜梭菌感染方面的有效性。这提示我们，Lys1472不仅可用于食品防腐，未来更有望作为一种新型“酶学抗生素”或兽用抗感染制剂，为防治产气荚膜梭菌引起的坏死性肠炎等疾病提供安全、高效且不易诱导耐药性的替代疗法。

最后，本研究为内溶素制剂的工程化改造与应用拓展奠定了坚实基础。尽管Lys1472整体性能优越，但其对Zn²⁺、Fe²⁺等特定金属离子的敏感性提示我们在应用过程中需通过剂型优化或蛋白工程技术予以改进。其宽广的pH和温度稳定性以及SH3B结合域的特异性识别机制，为后续通过蛋白质工程进一步提升其稳定性、扩大抗菌谱或增强环境适应性提供了明确的改造方向，有望推动更多定制化生物杀菌制剂的问世。

本文译自：

Application and potential therapeutic effect of endolysin Lys1472 against Clostridium perfringens in chicken meat

编译：吴志涛

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