【研究简介】

由亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室和广西大学郑德洪教授在mBio上发表名为《特洛伊木马病毒携带CRISPR-AsCas12f1控制植物青枯病》的研究性文章。在该研究中作者受古希腊寓言故事《木马计》启发，以丝状噬菌体为打入敌人内部的“木马”，以小型CRISPR-AsCas12f1为武器，靶向作用于青枯雷尔氏菌的致病基因之一hrpB基因，降低其致病能力从而达到提高易感植株的存活率的目的。并且工程噬菌体可在宿主菌钟传播，达到抑制野生菌株的比例。

【研究背景和目的】

细菌性病害是主要的植物病害之一，造成巨大的粮食和经济损失。噬菌体疗法作为一种环境友好的防治策略，在植物细菌性病害防治中被频繁报道。然而，噬菌体的宿主特异性、对紫外光和特定条件的敏感性以及细菌对噬菌体的抵抗能力，限制了噬菌体疗法在作物生产中的广泛应用。丝状噬菌体具有不裂解宿主菌和最小负荷的特点，为克服裂解性噬菌体生物防治的局限性提供了一种潜在的解决方案。本研究开发了一种对非模式丝状噬菌体具有广泛适用性的基因工程方法，并首次证明了基于噬菌体的工程化基因传递在植物细菌病害生物防治中应用的可能性。

【研究内容与结果】

1. 青枯病原菌中原噬菌体的挖掘

作者利用 PHASTER 工具分析了 74 株青枯菌株（包括 50 株 I 型、9 株 II 型、3 株 III 型和 12 株 IV 型），发现其中 63 株含有至少一条完整的原噬菌体序列，共识别出 152 条完整序列。这 50 条丝状噬菌体分布于 42 株青枯菌（36 株 I 型，4 株 II 型，2 株 III 型），表明丝状噬菌体在青枯菌 I、II 和 III 型菌株中广泛存在。从中国广西南宁嫁接节瓜中分离的 I 型菌株 Cq05 基因组测序表明，其含有五个原噬菌体区域，其中 region5（6.8 kb）被预测为完整的丝状噬菌体，编码 11 个开放阅读框（ORFs）。这些 ORFs 与已报道的丝状噬菌体 RSS1（序列号：NC_008575）高度同源，其中 orf5 编码次要衣壳蛋白，orf8 编码主要衣壳蛋白 pVIII，orf6 编码 pIII 蛋白。推测 region5 编码的潜在丝状噬菌体命名为 RSCq。

图 1  青枯病原菌中原噬菌体的挖掘

2.丝状噬菌体RSCq的鉴定

为了分离丝状噬菌体 RSCq，作者利用了其与宿主菌的共生特性，即丝状噬菌体会持续从宿主菌中分泌。通过双层琼脂平板实验，作者在 Cq05 的培养上清中检测到了 RSCq，使用青枯菌 GMI1000 作为宿主菌，观察到小而浑浊的噬菌斑。随后通过两轮单个噬菌斑的挑取与感染，对噬菌斑进行了纯化。分离的 RSCq 使用 GMI1000 进行培养，并通过 PCR 检测验证了其存在。如图 2A 所示，作者以感染复数（MOI）为 10 的条件，将 RSCq 接种至测试的宿主菌中。来自中国广西苦瓜的 青枯菌 I 型菌株 Bg06 和 Bg07 也被分离并测试。结果显示，RSCq 显著延缓了 GMI1000、Bg06 和 Bg07 的生长，但未引起菌体裂解，这与丝状噬菌体的生物学特性一致。丝状噬菌体通常在病毒颗粒中具有环状单链 DNA（ssDNA）基因组，但在宿主菌中会形成双链复制型（RF）DNA。通过质粒 DNA 纯化方法，作者提取了 RSCq 的 RF DNA，并使用结合 orf1 和 orf11 的引物扩增并测序了基因组连接位点的序列。意外地，扩增产物长度为 925 bp，比基于 PHASTER 分析预测的 295 bp 长，表明 RSCq 的基因组比预期更大。随后通过桑格测序对 RSCq 全基因组进行了测序，修正后的基因组长度为 7,480 bp（图 2B），并存储于 GenBank（登录号：OR088903）。

图 2  丝状噬菌体RSCq的鉴定

3.工程噬菌体构建的新方法

作者通过番茄和烟草的茎部注射实验，评估了噬菌体 RSCq 感染对青枯菌致病性的影响。结果显示，感染噬菌体与未感染噬菌体的青枯菌之间未见显著差异。在烟草自然接种实验中，RSCq 感染延缓了青枯病的症状出现，但最终的病害指数与对照组相似。基于这一结果，作者着手构建能够传递生物防治因子的工程化噬菌体。外源目标基因的插入位点对噬菌体的基因工程至关重要，这需要深入研究噬菌体的功能基因组学。作者提出了一种针对非模式噬菌体的全新基因工程方法，将 RSCq 的双链复制型（RF）DNA 作为质粒，在大肠杆菌中独立复制，并利用 Tn5 转座酶进行改造。使用改良的 EZ-Tn5插入试剂盒，其中转座子携带了受 lac 启动子控制的 eYFP 基因，位于转座酶识别序列（ME）和卡那霉素抗性基因（KanR）之间。该外源基因盒通过 Tn5 转座酶随机插入 RSCq RF DNA 中。随后，含有转座子的质粒文库通过电转化导入青枯菌 GMI1000，筛选对宿主菌有生长抑制作用的工程化噬菌体。结果表明，三种转化子的上清液对 GMI1000 显示生长抑制作用，推测工程化噬菌体已成功分泌，命名为 RSCqYFP01、RSCqYFP02 和 RSCqYFP03。通过桑格测序，确定了工程化噬菌体中外源基因的插入位点。RSCqYFP01 的外源基因插入在 orf1 下游非编码区域的 553–554 bp 处；RSCqYFP03 的插入位点为 561–562 bp；RSCqYFP02 的插入位点为 6,168–6,169 bp，位于 orf10 的 3′ 端。

图 3  基于RSCq的工程噬菌体构建

4. 工程噬菌体RSCqYFP01的感染特性

为了验证工程化丝状噬菌体的感染能力，作者将 RSCqYFP01、RSCqYFP02 和 RSCqYFP03 与青枯菌 GMI1000 在 BG 培养基中共培养。由于工程化噬菌体携带了卡那霉素抗性基因，研究者通过筛选获得感染的青枯菌细胞。正如图 4A 所示，在接种后不同时间点（0、4、8 和 12 小时），细菌培养物被涂布到含或不含卡那霉素的 BG 平板上，结果表明，与工程化噬菌体共培养的青枯菌获得了卡那霉素抗性。接种 12 小时后，计算 BG 平板上含或不含卡那霉素的菌落形成单位（CFU）以量化感染效率。如图 4B 所示，超过 85% 的青枯菌在感染 12 小时后表现出卡那霉素抗性。这表明工程化丝状噬菌体在宿主菌中具有高效感染能力，“特洛伊木马”型病毒的原型已成功构建。在工程化噬菌体中，RSCqYFP01 被选为后续研究对象。此外，作者测试了 19 株来自中国广西不同植物宿主的青枯菌 I 型菌株，以评估工程化噬菌体的宿主范围。将 RSCqYFP01 与青枯菌在 BG 培养基中共培养 12 小时后，进行卡那霉素抗性筛选。如图 4C 所示，RSCqYFP01 成功感染了 20 株测试菌中的 19 株，表明该工程化噬菌体在青枯菌 I 型菌株中具有广泛的宿主范围。

图 4  工程噬菌体的感染特性

5. 目标基因可以通过工程噬菌体传递至宿主细菌中

在构建工程化噬菌体时，作者将 eYFP 基因引入转座子。将 RSCqYFP01 与青枯菌 GMI1000 在 BG 培养基中共培养 48 小时后，在荧光显微镜下观察到感染细菌发出黄绿色荧光信号（图 5A）。相比之下，被母噬菌体 RSCq 感染的细菌未见荧光信号。荧光密度检测结果显示，未感染和 RSCq 感染菌株仅有背景荧光，而 RSCqYFP01 感染菌株检测到高荧光密度（图 5B）。为进一步验证外源基因的递送与表达，作者将 eYFP 基因替换为 luxA 和 luxB 基因，分别构建了工程化噬菌体 RSCqluxA 和 RSCqluxB。LuxAB 二聚体酶可催化生物发光反应，发出蓝绿色光。将青枯菌 GMI1000 与 RSCqluxA 和 RSCqluxB 在 BG 液体培养基中共培养 24 小时后，对感染细菌进行梯度稀释，并在加入发光底物醛后测量生物发光。结果显示，RSCqluxA/RSCqluxB 共感染的 GMI1000 发出强烈生物发光信号，而野生型 GMI1000、单独感染的 RSCqluxA 或 RSCqluxB 未见发光（图 5C）。发光强度（RLU）与细菌浓度呈线性相关。将稀释的感染细菌涂布在 BG 平板上，喷洒发光底物后，通过发光成像系统观察到菌落的发光，表明 RSCqluxA 和 RSCqluxB 能共同感染单个青枯菌细胞。将 RSCqluxA 和 RSCqluxB 感染的青枯菌（即 RSCqluxA/GMI1000 和 RSCqluxB/GMI1000）交叉涂布在 BG 平板上，喷洒发光底物后在交叉区域检测到发光（图 5D），这表明工程化噬菌体可从感染细胞中持续分泌，并感染周围宿主细胞。上述结果证明，工程化噬菌体可高效递送并在宿主细胞中表达外源基因，通过“特洛伊木马”策略将外源基因成功传递至青枯菌内部并发挥作用。

图 5  目的基因可以通过工程噬菌体传递到宿主细菌中

6. 传递CRISPR-AsCas12f1的工程噬菌体靶向青枯菌的hrpB

hrp 基因（超敏反应与致病性基因）编码 III 型分泌系统（T3SS），通过其效应蛋白（T3Es）是青枯菌的重要致病因子之一。破坏 hrpB 基因（hrp 基因关键调控因子）可使青枯菌丧失毒性，成为对抗青枯病的生物防治剂。作者计划利用工程化噬菌体，将靶向 hrpB 的 CRISPR-Cas 系统传递至自然环境中的青枯菌，削弱其致病力，将其转化为无毒的生物防治剂。CRISPR-Cas9 系统被克隆至噬菌体载体，但由于工程化噬菌体的货物容量有限，未能获得具有感染性的噬菌体。随后，选择了来自 Acidibacillus sulfuroxidans 的迷你型 V-F 类 CRISPR-Cas 系统（CRISPR-AsCas12f1），用于基因编辑（图 6A）。将 AsCas12f1 基因置于 lac 启动子下，并添加 6*His 标签。设计了 3 个靶向 hrpB ORF 不同区域的 sgRNA 以及两段 400 bp 同源臂，用于基因编辑。由于青枯菌缺乏非同源末端连接（NHEJ），AsCas12f1、sgRNA 和同源臂被克隆到载体 pRSCqYFP01 中，但载体过大无法生成感染性噬菌体。通过 Gibson 拼接法删除 R6kγori（780 bp），将 3 段 PCR 扩增的 DNA 片段直接组装后转化至缺失 hrpB 的青枯菌 ΔhrpB 中，以生成感染性噬菌体（R6kγori 缺失 DNA 无法在大肠杆菌中复制）。最终得到含 CRISPR-AsCas12f 系统的感染性噬菌体 RSCqCRISPR-Cas，并构建了不含 sgRNA 和同源臂的对照噬菌体 RSCqCas。感染青枯菌 GMI1000 24 小时后，通过 6*His 标签的单克隆抗体进行 Western blot 分析（图 6B）。在 RSCqCRISPR-Cas 感染菌株中检测到 49.5 kDa 的 AsCas12f1 蛋白，而未在 GMI1000 或 RSCqYFP01 感染菌株中检测到，表明 AsCas12f1 已成功传递并在细胞内表达。为评估 CRISPR-AsCas12f1 的基因编辑效果，将 GMI1000 与 RSCqCRISPR-Cas 在 BG 和 MP 培养基中共培养 48 小时后，将培养物稀释并涂布在 BG 平板上，于 28°C 或 37°C 培养。通过 PCR 检测同源臂区域的编辑情况。结果显示，在 BG 培养基中未检测到基因编辑；而在 MP 培养基中培养时，28°C 条件下随机选取的大多数菌落表现出野生型和 hrpB 缺失型菌落。37°C 培养时，出现野生型、hrpB 缺失型、杂合型（同时显示野生型和缺失型条带）及可能的脱靶菌落（无条带）（图 6C）。这表明 CRISPR-AsCas12f1 系统成功编辑了目标基因 hrpB，但编辑效率和准确性尚需优化以支持基因功能研究。

图 6  传递CRISPR-AsCas12f的工程噬菌体靶向青枯菌GMI1000的hrpB

7.利用基因工程噬菌体RSCqCRISPR-Cas可有效控制植物细菌性枯萎病

为评估工程丝状噬菌体在土壤中的感染效率及其生物防治潜力，进行了相关试验。结果显示（图 8A），将青枯菌 GMI1000 以 10⁸ CFU/克的浓度引入土壤后，1 天后用 RSCqYFP01 处理。根据抗卡那霉素菌落的比例，经过 8 天的处理后，82.6% 的青枯菌细胞被感染（图 8B）。这表明“特洛伊木马”病毒能够高效感染土壤环境中的青枯菌。随后，以烟草品种云烟 87 作为测试宿主植物，研究工程噬菌体对植物青枯病的生物防治效果。目标基因 CRISPR-AsCas12f 在青枯菌 Tb04（BioProject ID PRJNA616449）的基因组中高度保守。试验中（图 8A），Tb04 以 10⁸ CFU/克的浓度引入土壤，1 天后进行工程噬菌体感染。土壤保持湿润 8 天，以充分感染青枯菌。随后，将 3 周龄烟草幼苗移栽至 Tb04 污染土壤中，分别进行了有噬菌体或无噬菌体处理的对比试验。尽管 RSCq 和 RSCqYFP01 处理能够延缓青枯病症状的出现，但最终发病指数与未处理土壤相似（图 8C、D）。然而，经 RSCqCRISPR-Cas 处理的土壤种植的烟草存活率显著高于其他处理组。RSCqCRISPR-Cas 处理有效控制了烟草青枯病，生物防治效率达 59.2%。即，“特洛伊木马”病毒携带 CRISPR-AsCas12f，帮助植物抵御青枯菌的侵害。

图 7  工程噬菌体RSCqCRISPR-Cas对植物青枯病的生物防治效果

【结论】

由病原青枯菌引起的植物细菌性枯萎病造成了巨大损失，传统的噬菌体疗法局限性较大，亟需新的解决方案。该研究通过基因组挖掘，成功分离出青枯菌的丝状噬菌体RSCq并构建了工程化噬菌体RSCqCRISPR-Cas。这一工程化噬菌体能够将CRISPR-AsCas12f系统有效输送到细菌中，成功靶向hrpB基因，从而削弱病原菌的毒力。该方法利用丝状噬菌体的特性克服了传统噬菌体疗法中的诸多限制，其本质在于利用CRISPR技术精确编辑病原菌的基因。

【启示】

该方法利用丝状噬菌体的特性克服了传统噬菌体疗法中的诸多限制，可以在致病菌中传播和表达并精确编辑病原菌的基因；整合在致病菌基因组内，使得噬菌体不会因环境变化（温度、水分、紫外）而受到过多影响。此外有助于全面理解植物与病原菌之间的相互作用，展示了工程化丝状噬菌体作为新型生物控制剂在农业中应用的可行性。

本文译自：

Trojan Horse virus delivering CRISPR-AsCas12f1 controls plant bacterial wilt caused by Ralstonia solanacearum

编译：石德喜  李孟霖