【研究简介】

由阿拉加帕大学科学园区生物技术系在Int. J. Biol. Macromol上发表名为《壳聚糖包封噬菌体鸡尾酒作为有前景的口服递送系统用于对抗产气克雷伯菌引起的胃肠道感染》的研究文章。在该研究中作者考虑到噬菌体在对抗人类肠道致病菌方面具有潜力，但其治疗效果受胃部严苛环境(包括低pH和消化酶)限制，开发一种天然保护机制，通过口服递送噬菌体治疗产气克雷伯菌引起的胃部感染，为靶向肠道细菌的功能性噬菌体递送提供了可行、高效且经济的策略。

【研究背景和目的】

在 21 世纪快速发展的格局中，抗菌素耐药性已成为全球性严峻挑战。产气克雷伯菌(Klebsiella aerogenes)是臭名昭著的 ESKAPE 病原体，常见于医疗环境。该菌在医疗器械上形成的生物膜相关感染显著增加发病率、死亡率和医疗成本。噬菌体疗法已成为对抗耐药病原体的有前景替代方案，具有宿主特异性、成本效益高及对正常菌群干扰小等独特优势。通过组合靶向不同细菌受体的噬菌体制备鸡尾酒制剂，可拓宽疗效并减少耐药性发展。但噬菌体疗法的关键挑战在于口服制剂的活菌递送，胃部低 pH 环境及消化酶可能使噬菌体在抵达靶标前失活。将噬菌体封装于生物材料基质中可保护其免受胃肠道严苛环境影响，确保精准递送。该技术不仅能提升噬菌体治疗胃肠道感染的潜力，还可扩展至多重耐药菌的应对。本研究采用壳聚糖基质封装的噬菌体鸡尾酒(ASKa 与 KSKa)提升疗效，重点评估模拟胃酸条件下对产气克雷伯菌的裂解能力，并通过噬菌体表征、基因组分析、浮游细胞裂解及成熟生物膜破坏等综合评价，并利用蜡螟感染模型结合组织病理学评估体内效果。

【研究内容与结果】

1. 两种噬菌体的分离、纯化及表型分析

作者从污水样本中分离出 ASKa 与 KSKa 噬菌体，并双层琼脂(DLA)技术进行噬菌体纯化，对纯化后的噬菌体进行了表型分析，ASKa 和 KSKa 均归类于有尾病毒目，两者均呈现 Autographiviridae 科的典型特征。吸附动力学显示ASKa 在 8 min 分钟内吸附率超 99%，KSKa 则在12 分钟内完成吸附。潜伏期分析显示 ASKa 和KSKa 的潜伏期为 20 min，ASKa 在40 min 后进入平台期，而 KSKa 则在 60 min 后达到平台期，经计算得出 ASKa 的爆发量为每个细胞产生 204 个噬菌体颗粒，KSKa 为每个细胞产生 226 个噬菌体颗粒。在不同温度下评估了 ASKa 和 KSKa 噬菌体的感染活性，当温度升至 65℃两种噬菌体的感染活性急剧下降，并在 70℃ 时完全丧失。ASKa 在 pH4 至 10 范围内表现出优异的稳定性。相比之下，KSKa 仅在 pH6 至 8 之间保持感染活性。

图 1. ASKa 与 KSKa 噬菌体的表型分析表征

2.产气克雷伯菌浮游细胞敏感性

作者采用产气克雷伯菌浮游细胞，在不同感染复数(MOI 0.1、1 和 10)条件下评估了 ASKa、KSKa 及噬菌体鸡尾酒疗法在 24 h 内的抗菌潜力。经噬菌体处理的细菌在 MOI 为 1和 10 时生长速度显著慢于未处理对照组。值得注意的是，当 MOI 为 1 时，噬菌体鸡尾酒组表现出最强的生长抑制效果，最高可达约 90% 的抑制率。在 MOI 10 条件下，ASKa 组(平均6.97 log₁₀CFU/mL)、KSKa 组(7.41 log₁₀ CFU/mL)和鸡尾酒组(8.15 log₁₀CFU/mL)的菌落数均显著低于对照组。

图 2. ASKa 与 KSKa 噬菌体对产气克雷伯菌浮游细胞敏感性评估

3.生物膜对 ASKa 与 KSKa 噬菌体的敏感性

作者采用改良版 Kim 氏法评估噬菌体抑制生物膜形成的能力。数据显示 ASKa、KSKa 及鸡尾酒噬菌体能在 10 h 内有效降低产气杆菌生物膜密度。在48 h 时，ASKa 组和 KSKa 组分别达到最高清除率 99.3% 和 98.2%。与未处理对照组相比，噬菌体鸡尾酒疗法在 10 h 处理时间内实现了 99% 的清除率。将细胞接种于 MHA 琼脂平板并通过菌落计数验证结果。当两种噬菌体共存时，细菌细胞数量急剧下降。此外，采用双层琼脂法(DLA)定量噬菌体生长并测定噬斑形成单位(PFU)。ASKa 和 KSKa 噬菌体在样本中的浓度分别最高提升 4 个和 5个数量级，而噬菌体鸡尾酒组则达到 6 个数量级的增长。在 48 h 后未观察到生物膜再生现象。这些结果证实了噬菌体对 MOI 10 条件下生物膜内固着态产气克雷伯菌细胞的显著抑制作用。

图 3. 对产气克雷伯菌生物膜的治疗效果

4. 封装噬菌体稳定性与保水性分析

作者评估了封装微珠的形态，图中展示了壳聚糖包被微珠的理想结构模型，为理解封装方法提供了可视化参考。作者采用细菌菌苔斑点试验评估含噬菌体的壳聚糖包被微珠活性，根据 MOI 浓度观察到的透明带证实噬菌体成功包埋于微珠内。

阴性对照(NC)含 5%海藻酸钠、0.01%酪蛋白、2%明胶和 2%商品蜂蜜，未显示任何抑菌活性，表明无噬菌体时不产生透明带。相较而言，即便在 MOI 为 0.1 时，混合噬菌体产生的透明带直径仍显著大于单一噬菌体 ASKa 和 KSKa。此外，壳聚糖包被微珠的含水量可稳定保持长达一个月。相比之下，未包被壳聚糖的微珠迅速脱水，水分在 24 h 内流失。这种保水稳定性证实了壳聚糖包被对维持封装噬菌体的有效性，彰显其在口服噬菌体递送系统中的应用潜力。

图 4. 噬菌体封装形成过程

5. 微珠封装噬菌体的稳定性与活性评估

作者通过测定 80∘C 热处理 0.5、1 和 5 min 小时后从微珠释放的噬菌体效价，研究各基质组分的热保护作用。5 分钟孵育后，游离噬菌体失活；1 号微珠展现中等耐热性(效价降低 5.6 至5.8 log₁₀PFU/mL )，而含蜂蜜、明胶和酪蛋白配方的 2 号壳聚糖包被微珠表现出更强耐热性(效价仅降低 1.1 至 1.4 log₁₀PFU/mL )。在 37∘C 条件下，比较不同酸度 pH 环境中壳聚糖包被微珠2 号与 1 号微珠及游离噬菌体的稳定性。pH1.4 处理后恒定的效价回收表明，含海藻酸钠、酪蛋白、明胶和蜂蜜的 2 号微珠比 1 号微珠及游离噬菌体更具耐酸性。在模拟胃液中孵育后评估含噬菌体微珠的释放特性， 2 h 孵育期间微珠持续表现良好性能，效价维持在 4.4 至 1.9 log₁₀ PFU/mL 。1 号和 2 号微珠分别在 3 至 5 h 小时内实现噬菌体完全释放。

图 5. 包封珠的稳定性与活性

6. 肠道模拟液中噬菌体介导的细菌裂解机制研究

作者在模拟肠道条件下(感染复数 MOI 为 0.1)，研究了珠1、珠2 和游离噬菌体对产气克雷伯菌的强效作用。结果显示，游离噬菌体初期对产气克雷伯菌活菌数产生显著降低，ASKa达4.4 log₁₀CFU/mL，KSKa达4.2 log₁₀CFU/mL，噬菌体鸡尾酒在 4 h 后达6.3 log₁₀CFU/mL。但随着模拟肠道条件下孵育时间延长，其致病活性逐渐减弱。另一方面，珠1 包封的噬菌体对产气克雷伯菌的杀灭作用存在延迟，这与噬菌体的缓释特性相符。珠1包封处理在 12 h 后达到最大杀灭效果：ASKa为 2.8 log₁₀CFU/mL，KSKa为 2.9 log₁₀CFU/mL，鸡尾酒为 4.3 log₁₀CFU/mL，该效果与游离噬菌体在 4 h 时的致病活性相当。在壳聚糖包衣的珠 2 中，包封噬菌体处理在 12 h 时达到最强杀灭效果:ASKa为 4.9 log₁₀CFU/mL，KSKa为 4.7 log₁₀CFU/mL，鸡尾酒为 5.9 log₁₀CFU/mL。这些杀灭效果与游离噬菌体在 4 h 时的毒力活性也具有可比性。这些发现阐明了模拟肠道环境中游离与包封噬菌体毒力动力学的差异。经壳聚糖包衣的噬菌体珠浓度在模拟肠液中遭遇病原体感染后增长 10000 倍，从初始滴度 1.2 × 108PFU/mL 经 12 h 后显著提升，该扩增幅度远超游离噬菌体处理观察到的十倍增长。

图 6. 人工胃肠环境中噬菌体的裂解效率

7. 利用大蜡螟幼虫对封装噬菌体进行体内功效评估

治疗模型中的幼虫在注射混合噬菌体前已感染产气克雷伯菌 2 h。注射产气克雷伯菌的对照组幼虫出现黑化现象，与阴性对照相比死亡率约为 90%。3 至 4 天后，分别用 ASKa 和 KSKa 噬菌体处理的幼虫存活率约为 75%和 70%。在混合噬菌体组中，感染复数(MOI)为 10 的噬菌体治疗 2 天内观察到 100%存活率。除 MOI 10 的混合噬菌体治疗组，所有组别在感染后第 5 天均出现黑化及死亡。当使用 MOI 0.1、1 和 10 的噬菌体进行预处理时，幼虫存活率分别为93%、97%和 100%。ASKa 和 KSKa 噬菌体组的幼虫死亡率显著低于阳性对照。在 MOI 10条件下，这两种噬菌体还分别将幼虫体内细菌负荷降低约 89%和 82% %。

图 7. 噬菌体效力的体内评估

8. 大蜡螟幼虫组织学解析

显微镜分析显示各实验组存在显著的组织反应差异。空白对照组组织呈现正常组织结构，特征包括完整的上皮层、清晰的细胞结构和健康的肌纤维，表明无不良反应。产气克雷伯菌感染对照组中观察到显著的组织病理学改变，包括大面积组织损伤。检测显示坏死病灶、上皮完整性破坏及明显的炎症细胞浸润。此外还发现色素结节，表明血细胞在细菌周围聚集形成强烈的免疫反应，这种现象与黑化相关。该防御机制旨在隔离和中和幼虫体腔内的病原体。相比之下，混合噬菌体治疗组的组织学特征与空白对照组相当，组织结构保存完好，未见明显坏死或炎症迹象。噬菌体处理的幼虫组织显示健康的上皮细胞和肌纤维，表明有效缓解了产气克雷伯菌感染引发的病理效应。这些结果凸显了噬菌体疗法在维持组织完整性和促进细菌攻击后恢复中的保护作用。

图 8. 幼虫组织病理学分析

【结论】

壳聚糖-海藻酸盐微球包埋噬菌体鸡尾酒能有效抵御低 pH 危害，确保缓释效果与持续抗菌活性。未受保护的游离噬菌体在 pH3 条件下即失活。单独使用海藻酸钠(SA)包封(微珠 1)可使噬菌体在pH2.5 下存活。更值得注意的是，由壳聚糖-SA 基质辅以蜂蜜、酪蛋白和明胶包封的噬菌体鸡尾酒(微珠 2)在 pH 1.5 仍保持活性。微球 2 中的噬菌体效价在 37℃ 的模拟肠液中呈现缓释特性，5 h 内近乎完全释放，确保有效递送至肠道环境。在此条件下，产气克雷伯菌接触微珠 2 后最大减少量达6.2 log₁₀CFU/mL，而微球 1 和游离噬菌体的最大减少量为 2.8 log₁₀CFU/mL。这种优化的微球包封法为靶向肠道细菌的功能性噬菌体递送提供了可行、高效且经济的策略。

【启示】

本研究所采用的包埋方法提供了一种经济实用的口服递送系统，在人类和兽医学领域防治肠道感染方面展现出广阔的应用前景。这也启示我们，封装材料与工艺在噬菌体制剂的开发过程中同样具有重要意义。未来，开发具有成本效益且高效的口服噬菌体产品，将有助于应对抗生素耐药性的挑战，推动噬菌体疗法在前沿医疗领域的创新与发展。

本文译自：

Chitosan-encapsulated bacteriophage cocktail as promising oral delivery system to surpass gastrointestinal infection caused by Klebsiella aerogenes

编译: 檀艳萍