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【文献速递】通过间接靶向实现牙龈卟啉单胞菌的噬菌体生物控制

发布时间：

2026-07-31

本文提出“间接靶向”策略：不直接靶向PG，而是利用裂解性噬菌体ΦSG005靶向其共黏附共生菌戈登链球菌（Streptococcus gordonii，SG），通过破坏SG为PG提供的黏附底座和互作信号，间接降低PG在双菌生物膜中的定植和代谢危害。

【研究简介】

牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，PG）是牙周致病生物膜中的关键成员，但目前尚未报道可直接感染PG的裂解性噬菌体。本文提出“间接靶向”策略：不直接靶向PG，而是利用裂解性噬菌体ΦSG005靶向其共黏附共生菌戈登链球菌（Streptococcus gordonii，SG），通过破坏SG为PG提供的黏附底座和互作信号，间接降低PG在双菌生物膜中的定植和代谢危害。

研究结果显示，在SG-PG双菌生物膜中，高滴度ΦSG005处理（10⁸ PFU·mL⁻¹）可使PG丰度相对未处理对照下降超过99%，同时使SG丰度下降约95%，总生物膜量下降约44%，并显著抑制PG产生的细胞毒性短链脂肪酸（丙酸和丁酸）。值得注意的是，低滴度噬菌体处理（10⁴ PFU·mL^-1）反而使生物膜总量增加约50%，并诱导EPS/多糖含量增加，提示噬菌体剂量选择对生物膜控制具有决定性影响。

【研究背景和目的】

噬菌体因具有较高的宿主特异性和可自我扩增等特点，被广泛关注于病原菌生物控制。然而，噬菌体疗法在实际应用中存在若干限制，包括噬菌体难以穿透生物膜基质、靶菌密度不足以支持噬菌体扩增、部分靶菌难培养、某些病原菌难以分离到裂解性噬菌体，以及多菌群体系中致病功能并非由单一菌种决定等。对于PG而言，目前没有报道明确可用于直接靶向的裂解性噬菌体，这限制了传统“直接噬菌体靶向”思路的应用。

牙菌斑是典型的多菌种生物膜系统。SG作为口腔早期定植菌，可先在表面形成基础生物膜，并为晚期定植的PG提供黏附表面。PG的长菌毛FimA和短菌毛Mfa1能够分别与SG表面的GAPDH和SspA/B等蛋白互作，帮助PG共黏附并进入更适合生物膜形成的状态。因此，本文的核心目的是验证：能否通过靶向SG这一“辅助定植菌”，间接降低PG在双菌生物膜中的丰度、空间定植能力和毒性代谢产物输出，从而为难以直接获得裂解性噬菌体的病原菌控制提供概念验证。

【研究内容与结果】

本研究以SG 10558和PG 33277为模型菌株，建立了一个简化但机制明确的双菌生物膜体系。实验设计为：第一天接种SG，使其形成初级生物膜；第二天加入PG，使PG利用SG形成次级双菌生物膜；第三天移除含有浮游细胞的上清，在不扰动已形成生物膜的情况下加入不同滴度的ΦSG005（0、10²、10⁴、10⁶、10⁸ PFU·mL^-1）；继续厌氧培养24 h后，分别检测生物膜总量、两菌绝对丰度、空间结构、功能基因表达以及短链脂肪酸代谢物。

1、双菌生物膜模型与间接靶向策略

作者没有直接寻找PG噬菌体，而是利用PG高度依赖SG定植的生态关系，构建了“打掉底座、间接控制靶菌”的实验策略。SG在底层先形成初级生物膜，PG随后附着在SG表面形成双菌生物膜。加入ΦSG005前，作者先移除培养液中的浮游细胞，其目的在于排除游离细菌继续增殖或重新黏附的干扰，使后续检测更集中地反映噬菌体对已形成双菌生物膜的影响。

2、高滴度ΦSG005降低总生物膜量，但低滴度存在反向刺激效应

作者首先用结晶紫染色法检测双菌生物膜的总量。结晶紫法检测的是贴壁生物膜，包括细菌细胞、死细胞、细胞碎片以及EPS等胞外基质，而不是单纯的活菌数或某一种细菌的丰度。结果显示，10⁸ PFU·mL^-1 ΦSG005处理后，总生物膜量较对照下降约44%，说明高滴度噬菌体能够有效削弱双菌生物膜结构。

但低滴度处理呈现出相反结果：10⁴ PFU·mL^-1处理组的OD595显著升高，生物膜总量较对照增加约50%。这一现象提示噬菌体并非在任何剂量下都产生线性抑制作用，低滴度可能对宿主菌SG形成亚致死压力，诱导应激性EPS增加，从而造成生物膜增强。

图1. 不同滴度ΦSG005处理后双菌生物膜总量变化。作者采用结晶紫染色法测定OD595，结果显示高滴度10⁸ PFU·mL^-1可降低生物膜总量，而低滴度10⁴ PFU·mL^-1反而促进生物膜增加。

3、ΦSG005不能感染PG，但可通过破坏SG使PG丰度显著下降

接着，作者用qPCR分别检测残留生物膜中PG和SG的16S rRNA基因拷贝数。由于ΦSG005的宿主是SG，理论上其直接作用对象应为SG，而不是PG。但实验结果显示，当噬菌体滴度达到10⁶ PFU·mL^-1及以上时，PG和SG丰度均显著下降；10⁸ PFU·mL^-1处理后，SG丰度下降约95%，而PG丰度下降超过99%，PG的下降幅度反而超过了噬菌体宿主SG。

这一结果是本文“间接靶向”成立的关键证据。其原因在于PG不是独立稳定附着在孔板表面，而是高度依赖SG提供的黏附底座和共黏附信号。SG被裂解后，PG失去黏附位点并从生物膜中释放到液相，因此在残留贴壁生物膜中检测到的PG丰度显著降低。

图2. 不同滴度ΦSG005处理后残留双菌生物膜中PG和SG的绝对丰度。qPCR结果显示，10⁶和10⁸ PFU·mL^-1处理均可显著降低两种细菌丰度，其中10⁸ PFU·mL^-1处理后PG下降超过99%，SG下降约95%。

4、SG-PG共黏附机制解释PG为何下降更明显

SG在牙菌斑形成中属于早期定植菌，可为PG等厌氧晚期定植菌提供黏附表面。PG主要通过长菌毛FimA和短菌毛Mfa1与SG表面蛋白结合，从而实现共黏附。其中，FimA-GAPDH和Mfa1-SspA/B等互作不仅具有物理黏附作用，还可触发PG的表型变化，使其更容易进入生物膜形成状态。

因此，ΦSG005裂解SG后，不仅破坏了PG的“物理底座”，还会中断SG-PG之间促进PG自聚集和微菌落形成的信号级联。PG下降幅度超过SG，说明PG在该双菌体系中对SG的生态依赖性极强。

5、CLSM证明噬菌体剂量会重塑双菌生物膜空间结构

为了观察PG和SG在生物膜中的空间分布，作者进一步采用CLSM进行成像。图中PG以绿色显示，SG以红色显示。对照组中，PG细胞较密集地嵌入SG形成的初级生物膜内，两菌混合较充分；随着噬菌体滴度升高，PG和SG的残留细胞均变得稀疏，说明高滴度ΦSG005不仅减少细菌丰度，也破坏了生物膜三维结构。

低滴度处理则呈现另一种现象：10²和10⁴ PFU·mL^-1处理后，生物膜在侧视图中出现明显分层，下层主要为SG，上层主要为PG。作者认为，这可能与低滴度噬菌体刺激SG产生更多EPS有关，过量EPS将PG层向上推移，从而形成双层结构。

图3. CLSM观察不同滴度ΦSG005处理后的SG-PG双菌生物膜结构。PG为绿色，SG为红色。高滴度处理使两菌细胞减少并使生物膜变薄；低滴度处理则诱导明显分层，提示低剂量噬菌体可能刺激EPS产生并改变空间结构。

6、EPS/多糖实验进一步支持低滴度刺激效应

为了验证低滴度噬菌体是否诱导EPS增加，作者使用苯酚-硫酸法检测总多糖含量。结果显示，在双菌体系中，10⁴ PFU·mL^-1低滴度处理使总多糖含量显著增加约22%；而在仅含SG的单菌体系中，相同低滴度处理并未观察到明显的总生物膜量或多糖增加。

这说明低滴度刺激效应可能依赖于SG-PG双菌互作背景，而不仅仅是SG单独面对噬菌体的简单应激反应。作者也承认该机制仍未完全阐明，但该结果强调了一个重要事实：噬菌体剂量如果不足，可能不会削弱生物膜，反而可能通过亚致死应激诱导EPS过度产生，形成对目标病原菌更有利的保护环境。

7、RT-qPCR显示残留PG的黏附和群体感应相关基因上调

虽然高滴度噬菌体处理后PG丰度已降至很低水平，但作者进一步关注残留PG的功能状态。RT-qPCR结果显示，随着噬菌体滴度升高，残留PG中与共黏附相关的mfa1和fimA，以及与群体感应相关的luxS表达明显上调。在10⁸ PFU·mL^-1处理组中，mfa1和fimA分别上调约6倍和8倍，luxS上调约11倍。

这里的上调指的是这些基因的mRNA表达量升高，而不是DNA拷贝数增加。mfa1和fimA分别编码PG短菌毛和长菌毛，反映PG与SG共黏附的潜力；luxS参与LuxS/AI-2群体感应系统，反映PG的细胞间通讯、生物膜调控和应激适应能力。该结果提示，虽然大部分PG已被间接清除，但残留PG可能更倾向于重新黏附和再定植。

图4. 不同滴度ΦSG005处理后残留PG中mfa1、fimA和luxS的表达变化。纵坐标为相对于未处理对照的Log2 fold change。高滴度处理显著上调PG共黏附和群体感应相关基因，提示残留PG具有再黏附风险。

8、GC-MS检测表明高滴度处理降低PG短链脂肪酸代谢输出

PG对牙周病的危害不仅来自细菌定植本身，还来自其产生的细胞毒性代谢产物，如丁酸和丙酸。这些短链脂肪酸可穿透牙周组织，影响牙龈成纤维细胞、淋巴细胞和多形核白细胞功能，从而削弱宿主防御并促进牙周组织损伤。因此，作者进一步采用GC-MS检测噬菌体处理后丙酸和丁酸的产生情况。

与前面生物膜检测不同，短链脂肪酸实验中作者在加入噬菌体后没有去除含浮游细胞的液相，而是每隔2 h取出10%的液相用于检测，同时补充等量新鲜培养基。这种设计更适合观察PG产生并释放到液体培养基中的代谢物。正文结果显示，在未加噬菌体的对照组中，丙酸和丁酸在6 h内线性积累；10⁸ PFU·mL⁻¹噬菌体处理后，6 h时丁酸产生量降低约65%，丙酸产生量降低约94%；按PG细胞数归一化后，单细胞丙酸产生量也降低约80%。

图5. 10⁸ PFU·mL^-1 ΦSG005处理对PG产生短链脂肪酸的影响。作者用GC-MS检测丙酸和丁酸。正文结论为：与对照相比，噬菌体处理显著降低丙酸和丁酸积累，提示间接靶向SG可进一步削弱PG的有害代谢输出。

9、总结概念模型

文章最后用概念图总结了不同噬菌体滴度下的双菌生物膜变化。无噬菌体时，SG作为底层支架，帮助PG形成致病性生物膜；低滴度噬菌体可能诱导SG产生更多EPS，导致PG层被推高并形成分层结构；高滴度噬菌体则有效裂解SG，破坏PG所依赖的黏附底座，从而显著降低PG丰度并抑制其细胞毒性代谢产物产生。

图6. 间接噬菌体处理的概念模型。低滴度可能刺激EPS并造成PG层上移；高滴度则破坏SG底座，降低PG丰度和酸性代谢产物输出。

【讨论】

本文最大的创新点在于提出并验证了“间接噬菌体靶向”的可行性。传统噬菌体控制策略通常要求获得直接感染目标病原菌的裂解性噬菌体，但对于PG等难以分离到合适噬菌体的病原菌，这一路径受到限制。本文通过靶向PG的关键协同菌SG，证明可以利用微生物间依赖关系实现对目标菌的间接控制，从而拓展了噬菌体生物防控的应用范围。

从机制上看，本文不是简单证明“噬菌体减少细菌数量”，而是建立了较完整的证据链。OD595反映总生物膜量，qPCR区分PG和SG丰度，CLSM展示空间结构和分层现象，RT-qPCR揭示残留PG的再黏附和群体感应潜力，GC-MS进一步证明PG的细胞毒性代谢输出下降。多指标组合使文章结论比单独测OD或CFU更加完整。

本文也提示噬菌体剂量具有双刃剑效应。高滴度ΦSG005能够降低双菌生物膜总量和PG丰度，但低滴度反而促进EPS和生物膜量增加。这一发现对于噬菌体产品开发具有直接启示：不能简单认为“噬菌体越低越安全”，必须通过系统剂量-效应实验明确最低有效浓度、无效浓度及潜在刺激浓度，避免低剂量亚致死压力诱导生物膜保护性增强。

此外，Figure 4显示高滴度处理后残留PG中mfa1、fimA和luxS上调，说明即使PG总量显著下降，残留细胞仍可能具有增强再黏附和再定植的潜力。因此，作者建议将间接噬菌体处理与机械冲洗等破坏方法结合，例如刷牙、冲洗或洁治，以进一步去除从生物膜中释放或残留的PG。

本文的局限性也比较明确。首先，实验体系是简化的SG-PG双菌模型，不能完全代表真实口腔多菌种牙菌斑；其次，未进一步在动物口腔模型或临床样本中验证；再次，低滴度诱导EPS增加的分子机制尚不清楚；最后，若应用于复杂微生物群，可能需要噬菌体鸡尾酒或与其他生物膜破坏策略联合。

【启示】

对于难以获得直接裂解性噬菌体的病原菌，可以从生态依赖关系寻找突破口。PG依赖SG定植的关系为间接控制提供了天然靶点，这对其他多菌种生物膜体系也有借鉴价值，例如皮肤菌群、肠道菌群、慢性伤口生物膜和工业生物膜等。

本文对痤疮丙酸杆菌噬菌体、金黄色葡萄球菌噬菌体或相关裂解酶开发也有启发。不能只证明目标菌数量下降，还要观察是否诱导EPS增加、生物膜增强、残留菌黏附基因上调或微生态结构变化。尤其是低滴度刺激效应提示，剂量设计必须避免处于亚抑制区间。

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本文译自：

Phage-based biocontrol of Porphyromonas gingivalis through indirect targeting

编译：宋爽

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